細胞復蘇講究“快融”，越快融化，細胞所受損傷就越小。細胞復蘇的操作不復雜，但每一步都必須穩(wěn)扎穩(wěn)打，才能最大限度地提高復蘇存活率。

細胞復蘇步驟

步驟1：水浴鍋預熱至37℃備用

步驟2：準備15mL離心管，并向其中加入適量培養(yǎng)基待用

小貼士：離心管中加入4.5~9mL的培養(yǎng)基，比較難養(yǎng)的細胞，可適量增加培養(yǎng)基。

步驟3：將細胞凍存管從-80℃冰箱或液氮中取出，放入PE手套中，迅速投入水浴鍋

小貼士：如果冰箱或液氮距離水浴鍋路途較遠（步行超過1min），要把細胞先置于干冰上，再送至水浴鍋。如果將細胞凍存管直接放在手上或口袋里，可能導致溫度逐漸回升而產生冰晶損傷細胞。而將細胞凍存管裝在PE手套中，是為了預防污染。

步驟4：用力搖晃凍存管，使其在1分鐘內融化

小貼士：這一步越快融化越好，最好能放計時器在旁邊。如果1分鐘內沒有融化，可能是凍存液量偏多，或者搖晃力度不夠。

步驟5：用紙巾擦拭水漬，轉移至生物安全柜。用移液槍吸取細胞懸液，緩慢滴加到步驟2中準備好的離心管

小貼士：當同時復蘇多管細胞時，注意不要弄混。

步驟6：1200rpm離心3分鐘

小貼士：離心是為了去除DMSO，對于DMSO敏感的細胞，必須離心；若復蘇的細胞對DMSO不敏感，步驟6、步驟7可以省略，直接將培養(yǎng)基補足至10mL，接種至培養(yǎng)器皿中，第二天換液。

步驟7：棄上清，用新鮮培養(yǎng)基重懸細胞，接種至新的無菌培養(yǎng)器皿中

細胞復蘇操作示意圖

做完步驟7，細胞就復蘇好了。復蘇的細胞需要一段時間恢復狀態(tài)，當復蘇后的細胞密度低于80%時，48小時內不要換液，待細胞形態(tài)、生長速度等恢復正常，再進行細胞傳代等操作。（不要因為復蘇后兩三天細胞狀態(tài)不好就丟棄，應耐心等待至少一周。）

當然，細胞復蘇后狀態(tài)很好的情況下，可以提前開始后續(xù)的細胞培養(yǎng)實驗。