細胞名稱：ASPC-1/GEM 人轉移胰腺腺癌細胞吉西他濱耐藥株

貨號：WS-h005（STR（ASPC-1）鑒定）

規(guī)格：1×10?cells/T25培養(yǎng)瓶

用途：僅供科研使用

一、細胞特性

一個胰腺癌病人的腹水中的細胞移植到裸鼠后建立了這個細胞株。

1、來源：ASPC-1耐藥篩選

2、形態(tài)：上皮細胞樣，貼壁生長

3、細胞耐藥誘導過程

待細胞生長穩(wěn)定后，開始倍增藥物誘導劑量，每個劑量保持至細胞可以穩(wěn)定生長至匯合度達50%以上。遞增藥物濃度依次為：0.03μg/mL、0.3μg/mL、1.5μg/mL、3μg/mL、6μg/mL、12μg/mL、18μg/mL。約10個月后，細胞可在18μg/mL GEM藥物濃度下穩(wěn)定生長，視為耐藥細胞株構建成功，并命名為ASPC-1/GEM。

4、細胞培養(yǎng)試劑的配制

1）GEM藥物的配制及保存

建議將GEM藥物配制成18mg/mL的母液：即使用1mL DMSO溶液溶解18mg GEM藥物，使其完全溶解。

注意：可根據(jù)用量配置藥物，并將藥物分裝保存，避免反復凍融導致藥物失效。溶解后的GEM，4℃保存1周，-20℃保存1個月，-80℃保存6個月。

2）凍存液的配制

90%優(yōu)質胎牛血清+10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

3）完全培養(yǎng)基的配制

胎牛血清我們推薦 FBS500-WP-002

細胞培養(yǎng)條件

氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%；溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%~80%。

二、細胞處理

1）凍存細胞的復蘇

將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4~6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻，1000rpm/min離心3~5min，棄去上清液。加入1mL完全培養(yǎng)基重懸細胞后，均勻鋪于含6~8mL完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中，置于37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況，2~3day換液。

注意：①細胞復蘇過程中，不可使用含有藥物的培養(yǎng)基。須在細胞完全貼壁，形態(tài)完全展開，生長狀態(tài)穩(wěn)定后，方可根據(jù)實驗需要添加GEM藥物。若加藥后細胞生長狀態(tài)較為緩慢，可適當降低GEM的濃度，或使用不含GEM的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細胞生長狀態(tài)較好時，再更換為所需的GEM濃度；

②建議復蘇細胞時始終穿戴防護手套和面罩，避免凍存管因溫差較大而發(fā)生爆炸，造成人員傷害。

2）細胞傳代（建議以同等底面積的培養(yǎng)瓶/皿按照1：2比例傳代）

①待細胞密度達到80%~90%時，即可進行傳代培養(yǎng)。

②棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1次，吸凈殘余的PBS。

③加入適當體積的0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶-1mL，其它培養(yǎng)器皿可覆蓋培養(yǎng)底面即可），置于37℃培養(yǎng)箱中消化2~5min，顯微鏡下觀察細胞細胞大部分變圓并脫落，即可輕拍培養(yǎng)瓶使細胞全部脫落。迅速拿回操作臺，加入2倍體積的、含10%FBS的培養(yǎng)基中止消化。 

④將細胞懸液移入離心管中，1000rpm/min離心5min，棄去上清液。

⑤向細胞沉淀中加入1~2mL完全培養(yǎng)基重懸細胞，輕吹混勻。將細胞懸液按1：1的比例均勻鋪于2個新的培養(yǎng)瓶/皿中，添加6~8mL完全培養(yǎng)基，置于37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況，2~3day換液。

注意：細胞傳代過程中，不可使用含有藥物的培養(yǎng)基。須在細胞完全貼壁，形態(tài)完全展開，生長狀態(tài)穩(wěn)定后，方可根據(jù)實驗需要添加GEM藥物。若加藥后細胞生長狀態(tài)較為緩慢，可適當降低GEM的濃度，或使用不含GEM的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細胞生長狀態(tài)較好時，再更換為所需的GEM濃度。

3）細胞凍存

①細胞凍存時，步驟同2）細胞傳代的①~④，細胞計數(shù)后，加入配制好的細胞凍存液，重懸細胞，按照1×10^6 ~ 1×107個細胞/mL分配到一個凍存管中，標注好名稱、代數(shù)、日期等信息。

②將要凍存的細胞置于程序降溫盒中，-80℃冰箱中過夜，之后轉入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。