細(xì)胞培養(yǎng) | 貼壁細(xì)胞與懸浮細(xì)胞的凍存步驟及關(guān)鍵要點(diǎn)

在細(xì)胞運(yùn)輸或長(zhǎng)期不使用時(shí)，通常采用凍存方式進(jìn)行保存。規(guī)范的細(xì)胞凍存操作直接影響后續(xù)復(fù)蘇效果，因此凍存流程的嚴(yán)謹(jǐn)性至關(guān)重要。

本期編者將系統(tǒng)介紹貼壁細(xì)胞與懸浮細(xì)胞的凍存步驟及注意事項(xiàng)，幫助大家完善操作細(xì)節(jié)。

凍存前的準(zhǔn)備：可提前配制凍存液；若使用無(wú)血清非程序凍存液，則無(wú)需自行配制，也無(wú)需使用程序降溫盒。

一、貼壁細(xì)胞凍存步驟

1. 吸棄原有培養(yǎng)基，用PBS潤(rùn)洗細(xì)胞；

2. 吸棄PBS，加入胰酶消化，消化完成后使用完全培養(yǎng)基終止，并吹打均勻制成細(xì)胞懸液；

3. 以1200 rpm（約250g）離心3分鐘，徹底吸棄上清，收集細(xì)胞沉淀；

4. 加入配制好的凍存液重懸細(xì)胞。一個(gè)長(zhǎng)滿約80%的T25培養(yǎng)瓶可凍存1支，或按細(xì)胞計(jì)數(shù)以3~5×10? cells/支的密度凍存，每支凍存液用量建議為0.5~1 mL；

5. 分裝至凍存管，擰緊管蓋并做好標(biāo)記；

6. 將凍存管置于程序降溫盒中，于-80℃冰箱過(guò)夜；

7. 最后轉(zhuǎn)移至液氮中長(zhǎng)期保存。

二、懸浮細(xì)胞凍存步驟

1. 將細(xì)胞懸液直接以1200 rpm（約250g）離心3分鐘，盡量吸棄上清，收集細(xì)胞沉淀；

2. 用配制好的凍存液重懸細(xì)胞。一個(gè)傳代密度的T25培養(yǎng)瓶可凍存1支，或按細(xì)胞計(jì)數(shù)以3~5×10? cells/支的密度凍存，每支推薦使用0.5~1 mL凍存液；

3. 分裝至凍存管，擰緊管蓋并清晰標(biāo)記；

4. 置于程序降溫盒中，放入-80℃冰箱過(guò)夜；

5. 隨后轉(zhuǎn)移至液氮長(zhǎng)期保存。

三、注意事項(xiàng)

1. 凍存液應(yīng)提前配制，避免將DMSO直接加入細(xì)胞懸液；

2. 宜選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、匯合度約80%–90%的細(xì)胞進(jìn)行凍存，具體凍存密度可根據(jù)細(xì)胞特性調(diào)整；

3. 程序凍存盒、凍存液和完全培養(yǎng)基等需恢復(fù)至室溫再使用；

4. 凍存過(guò)程中應(yīng)避免消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、吹打過(guò)猛、離心轉(zhuǎn)速過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，以防細(xì)胞損傷；

5. 細(xì)胞長(zhǎng)期保存應(yīng)置于液氮中，不建議在-80℃條件下長(zhǎng)期存放；

6. 若無(wú)程序降溫盒，可依次按以下步驟降溫：室溫→4℃（20分鐘）→-20℃（30分鐘）→-80℃過(guò)夜→液氮保存，轉(zhuǎn)移過(guò)程中需注意保冷，防止溫度波動(dòng)或凍存管融化。